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ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗是目前臨床上常用的免疫學檢驗方法,由于其試劑穩(wěn)定,易保存,操作簡便,結果判斷較客觀,既適宜于大規(guī)模篩查試驗,又可用于少量標本的檢測,既可以做定性試驗也可以做定量分析,目前已廣泛用于微生物學、寄生蟲學、腫瘤學和細胞因子檢測等領域。
ELISA有敏感性高,特異性強,重復性好的特點,但其同時存在影響因素多的不足,現就實驗操作中常見的影響因素進行分析實驗,以提高的實驗質量。
ELISA試驗假陽性結果和假陰性結果解析
1、標本的采集與保存
ELISA試劑盒當標本采集保存不當產生溶血時,紅細胞中的血紅蛋白釋放到血清中,血紅蛋白具有過氧化物酶的性質,其通過吸附或“PP效應"(蛋白質間相互吸附的現象)結合后,可催化A、B液顯色而造成假陽性
標本采集保存不當致細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP,會產生假陽性反應;標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG聚合,易使間接法的試驗本底加深。因此,標本宜在新鮮時檢測。
反復凍融血清會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清標本如需保存做多次檢測,宜少量分裝凍存。
2、加樣
ELISA試劑盒如果 樣品稀釋液少加或血清多加,都會引起本底增高。對于間接法來說,受上述兩個因素影響更大。因為血清中受檢的特異性IgG只有IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強,非特異性IgG可直接吸附到固相載體上,有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標二抗發(fā)生反應而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多,高于規(guī)定的稀釋倍數,極易造成高值陰性。反之,造成假陰性。
如果加入的酶結合物過多或加在較高的孔壁上或孔口,也會引起本底升高或假陽性。
如果血液未開始凝固或凝固不全時就強行離心分離血清,此時的血清中仍留部分纖維蛋白原,在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊,易造成假陽性結果。
3. 溫育
由于ELISA試劑盒試驗在一定溫度下的反應時間并不是反應的終點,溫育時間過短、溫度過低,易致顯色不全;溫育時間過長、溫度過高,易致非特異性結合緊附于反應孔周圍,難以清洗徹di,產生陰性高值或假陽性反應。因此,要嚴格按規(guī)定的溫度和溫育時間進行。
由于水浴較難將溫度控制在穩(wěn)定的范圍,因此我們每次試驗時應認真觀察水浴箱的溫度,盡量少開啟水浴箱門,嚴格控制水浴的溫度為37±0.5。同時,微孔板不可重疊放置,以保證傳熱均勻,各板的溫度都能迅速達到平衡。
由于試劑盒通常設定的反應溫度為37度,在這個溫度下溫育一定時間,蒸發(fā)的水分會很多,對于整個反應體系來講,各種反應物的濃度會不斷地增加,這樣必會導致反應zui后的值升高。因此溫育時應貼上封板膠。